Kasalukuyang hindi pinagana ang Javascript sa iyong browser.Kapag hindi pinagana ang javascript, hindi gagana ang ilang function ng website na ito.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalonia, Spain * Ang mga may-akda na ito ay may ilang mga pananaw sa gawaing ito Equal background ng kontribusyon: Ang hyaluronic acid (HA) ay isang natural na nagaganap na polysaccharide na ginagamit sa paggawa ng mga dermal filler para sa aesthetic na layunin.Dahil mayroon itong kalahating buhay na ilang araw sa mga tisyu ng tao, ang mga dermal filler na nakabatay sa HA ay binago ng kemikal upang mapalawig ang kanilang buhay sa katawan.Ang pinakakaraniwang pagbabago sa komersyal na HA-based fillers ay ang paggamit ng 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) bilang isang crosslinking agent upang i-crosslink ang HA chain.Ang nalalabi o hindi na-react na BDDE ay itinuturing na hindi nakakalason sa <2 parts per million (ppm);samakatuwid, ang natitirang BDDE sa panghuling dermal filler ay dapat mabilang upang matiyak ang kaligtasan ng pasyente.Mga materyales at pamamaraan: Inilalarawan ng pag-aaral na ito ang pagtuklas at paglalarawan ng isang by-product ng cross-linking reaction sa pagitan ng BDDE at HA sa ilalim ng alkaline na kondisyon sa pamamagitan ng pagsasama-sama ng liquid chromatography at mass spectrometry (LC-MS).Mga Resulta: Pagkatapos ng iba't ibang pagsusuri, napag-alaman na ang alkaline na mga kondisyon at mataas na temperatura na ginamit upang disimpektahin ang HA-BDDE hydrogel ay nagsulong ng pagbuo ng bagong by-product na ito, ang "propylene glycol-like" compound.Kinumpirma ng pagsusuri ng LC-MS na ang by-product ay may parehong monoisotopic mass gaya ng BDDE, ibang retention time (tR), at ibang UV absorbance (λ=200 nm) mode.Hindi tulad ng BDDE, naobserbahan sa pagsusuri ng LC-MS na sa ilalim ng parehong mga kondisyon ng pagsukat, ang by-product na ito ay may mas mataas na rate ng pagtuklas sa 200 nm.Konklusyon: Ang mga resultang ito ay nagpapahiwatig na walang epoxide sa istraktura ng bagong tambalang ito.Bukas ang talakayan para masuri ang panganib ng bagong by-product na ito na makikita sa paggawa ng HA-BDDE hydrogel (HA dermal filler) para sa mga komersyal na layunin.Mga keyword: hyaluronic acid, HA dermal filler, cross-linked hyaluronic acid, BDDE, LC-MS analysis, BDDE by-product.
Ang mga filler batay sa hyaluronic acid (HA) ay ang pinakakaraniwan at tanyag na dermal filler na ginagamit para sa mga layuning kosmetiko.1 Ang dermal filler na ito ay isang hydrogel, kadalasang binubuo ng >95% na tubig at 0.5-3% HA, na nagbibigay sa kanila ng parang gel na istraktura.Ang 2 HA ay isang polysaccharide at ang pangunahing bahagi ng extracellular matrix ng mga vertebrates.Isa sa mga sangkap.Binubuo ito ng (1,4)-glucuronic acid-β (1,3)-N-acetylglucosamine (GlcNAc) na paulit-ulit na mga unit ng disaccharide na konektado ng mga glycosidic bond.Ang disaccharide pattern na ito ay pareho sa lahat ng organismo.Kung ikukumpara sa ilang mga filler na nakabatay sa protina (tulad ng collagen), ginagawa ng property na ito ang HA na isang lubos na biocompatible na molekula.Ang mga filler na ito ay maaaring magpakita ng pagtitiyak ng pagkakasunud-sunod ng amino acid na maaaring makilala ng immune system ng pasyente.
Kapag ginamit bilang isang dermal filler, ang pangunahing limitasyon ng HA ay ang mabilis na paglilipat nito sa loob ng mga tisyu dahil sa pagkakaroon ng isang partikular na pamilya ng mga enzyme na tinatawag na hyaluronidases.Sa ngayon, maraming mga pagbabago sa kemikal sa istraktura ng HA ang inilarawan upang madagdagan ang kalahating buhay ng HA sa mga tisyu.3 Karamihan sa mga pagbabagong ito ay nagtatangkang bawasan ang access ng hyaluronidase sa polysaccharide polymers sa pamamagitan ng cross-linking HA chain.Samakatuwid, dahil sa pagbuo ng mga tulay at intermolecular covalent bond sa pagitan ng HA structure at ng cross-linking agent, ang cross-linked HA hydrogel ay gumagawa ng mas maraming anti-enzyme degradation na produkto kaysa sa natural na HA.4-6
Sa ngayon, ang mga kemikal na crosslinking agent na ginamit upang makagawa ng crosslinked HA ay kinabibilangan ng methacrylamide, 7 hydrazide, 8 carbodiimide, 9 divinyl sulfone, 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) At poly(ethylene glycol) diglycidyl ether.Ang 10,11 BDDE ay kasalukuyang pinakakaraniwang ginagamit na ahente ng crosslinking.Bagama't ang mga uri ng hydrogel na ito ay napatunayang ligtas sa loob ng mga dekada, ang ginagamit na mga ahente ng crosslinking ay mga reaktibong reagent na maaaring cytotoxic at, sa ilang mga kaso, mutagenic.12 Samakatuwid, ang kanilang natitirang nilalaman sa panghuling hydrogel ay dapat na mataas.Ang BDDE ay itinuturing na ligtas kapag ang natitirang konsentrasyon ay mas mababa sa 2 bahagi bawat milyon (ppm).4
Mayroong ilang mga paraan upang matukoy ang low-residue na konsentrasyon ng BDDE, cross-linking degree at posisyon ng pagpapalit sa HA hydrogels, tulad ng gas chromatography, size exclusion chromatography na isinama sa mass spectrometry (MS), nuclear magnetic resonance (NMR) fluorescence measurement method, at Diode array na isinama ang high performance liquid chromatography (HPLC).13-17 Inilalarawan ng pag-aaral na ito ang pagtuklas at paglalarawan ng isang by-product sa huling cross-linked na HA hydrogel na ginawa ng reaksyon ng BDDE at HA sa ilalim ng alkaline na mga kondisyon.HPLC at likidong chromatography-mass spectrometry (LC-MS analysis).Dahil ang toxicity ng by-product na ito ng BDDE ay hindi alam, inirerekumenda namin na ang residue quantification nito ay dapat matukoy sa katulad na paraan sa paraang karaniwang ginagawa sa BDDE sa huling produkto.
Ang nakuha na sodium salt ng HA (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) ay may molecular weight na ~1,368,000 Da (Laurent method) 18 at isang intrinsic viscosity na 2.20 m3/kg.Para sa reaksyong crosslinking, binili ang BDDE (≥95%) mula sa Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA).Ang Phosphate buffered saline na may pH 7.4 ay binili mula sa Sigma-Aldrich Company.Ang lahat ng solvents, acetonitrile at tubig na ginamit sa pagsusuri ng LC-MS ay binili mula sa kalidad ng grado ng HPLC.Ang formic acid (98%) ay binili bilang reagent grade.
Ang lahat ng mga eksperimento ay isinagawa sa isang UPLC Acquity system (Waters, Milford, MA, USA) at nakakonekta sa isang API 3000 triple quadrupole mass spectrometer na nilagyan ng electrospray ionization source (AB SCIEX, Framingham, MA, USA).
Ang synthesis ng cross-linked HA hydrogels ay sinimulan sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 198 mg ng BDDE sa isang 10% (w/w) sodium hyaluronate (NaHA) na solusyon sa pagkakaroon ng 1% alkali (sodium hydroxide, NaOH).Ang huling konsentrasyon ng BDDE sa pinaghalong reaksyon ay 9.9 mg/mL (0.049 mM).Pagkatapos, ang pinaghalong reaksyon ay lubusan na halo-halong at homogenized at pinapayagan na magpatuloy sa 45 ° C sa loob ng 4 na oras.19 Ang pH ng reaksyon ay pinananatili sa ~12.
Pagkatapos nito, ang pinaghalong reaksyon ay hinugasan ng tubig, at ang panghuling HA-BDDE hydrogel ay sinala at natunaw ng PBS buffer upang makamit ang isang konsentrasyon ng HA na 10 hanggang 25 mg / mL, at isang panghuling pH na 7.4.Upang ma-sterilize ang ginawang cross-linked na HA hydrogels, ang lahat ng hydrogel na ito ay naka-autoclave (120°C sa loob ng 20 minuto).Ang purified BDDE-HA hydrogel ay nakaimbak sa 4°C hanggang sa pagsusuri.
Upang pag-aralan ang BDDE na naroroon sa cross-linked na produkto ng HA, ang isang 240 mg sample ay tinimbang at ipinasok sa gitnang butas (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; dami ng 0.5 mL) at sentripuged sa 10,000 rpm sa temperatura ng silid. 10 minuto.Isang kabuuan ng 20 µL ng pull-down na likido ang nakolekta at nasuri.
Upang masuri ang pamantayan ng BDDE (Sigma-Aldrich Co) sa ilalim ng mga kondisyong alkalina (1%, 0.1% at 0.01% NaOH), kung matutugunan ang mga sumusunod na kundisyon, ang sample ng likido ay 1:10, 1:100, o hanggang sa 1:1,000,000 Kung kinakailangan, gumamit ng MilliQ deionized na tubig para sa pagsusuri.
Para sa mga panimulang materyales na ginamit sa cross-linking reaction (HA 2%, H2O, 1% NaOH, at 0.049 mM BDDE), 1 mL ng bawat sample na inihanda mula sa mga materyales na ito ay nasuri gamit ang parehong mga kondisyon ng pagsusuri.
Upang matukoy ang pagtitiyak ng mga taluktok na lumilitaw sa mapa ng ion, 10 µL ng 100 ppb BDDE standard solution (Sigma-Aldrich Co) ay idinagdag sa 20 µL sample.Sa kasong ito, ang panghuling konsentrasyon ng pamantayan sa bawat sample ay 37 ppb.
Una, maghanda ng BDDE stock solution na may konsentrasyon na 11,000 mg/L (11,000 ppm) sa pamamagitan ng pagtunaw ng 10 μL ng standard BDDE (Sigma-Aldrich Co) na may 990 μL MilliQ na tubig (density 1.1 g/mL).Gamitin ang solusyon na ito upang maghanda ng 110 µg/L (110 ppb) na solusyon sa BDDE bilang isang intermediate standard dilution.Pagkatapos, gamitin ang intermediate BDDE standard diluent (110 ppb) para ihanda ang standard curve sa pamamagitan ng pagtunaw ng intermediate diluent nang ilang beses upang makamit ang nais na konsentrasyon na 75, 50, 25, 10, at 1 ppb.Tulad ng ipinapakita sa Figure 1, napag-alaman na ang BDDE standard curve mula 1.1 hanggang 110 ppb ay may magandang linearity (R2>0.99).Ang karaniwang curve ay naulit sa apat na independiyenteng mga eksperimento.
Figure 1 BDDE standard calibration curve na nakuha sa pamamagitan ng LC-MS analysis, kung saan ang isang magandang ugnayan ay sinusunod (R2>0.99).
Mga pagdadaglat: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl eter;LC-MS, liquid chromatography at mass spectrometry.
Upang matukoy at mabilang ang mga pamantayan ng BDDE na nasa cross-linked na HA at ang mga pamantayan ng BDDE sa base solution, ginamit ang pagsusuri ng LC-MS.
Nakamit ang chromatographic separation sa isang LUNA 2.5 µm C18(2)-HST column (50×2.0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) at pinananatili sa room temperature (25°C) sa panahon ng pagsusuri.Ang mobile phase ay binubuo ng acetonitrile (solvent A) at tubig (solvent B) na naglalaman ng 0.1% formic acid.Ang mobile phase ay na-eluted sa pamamagitan ng gradient elution.Ang gradient ay ang mga sumusunod: 0 minuto, 2% A;1 minuto, 2% A;6 minuto, 98% A;7 minuto, 98% A;7.1 minuto, 2% A;10 minuto , 2% A. Ang oras ng pagtakbo ay 10 minuto at ang dami ng iniksyon ay 20 µL.Ang oras ng pagpapanatili ng BDDE ay humigit-kumulang 3.48 minuto (mula 3.43 hanggang 4.14 minuto batay sa mga eksperimento).Ang mobile phase ay pumped sa isang daloy rate ng 0.25 mL/min para sa LC-MS analysis.
Para sa BDDE analysis at quantification ng MS, ang UPLC system (Waters) ay pinagsama sa isang API 3000 triple quadrupole mass spectrometer (AB SCIEX) na nilagyan ng electrospray ionization source, at ang pagsusuri ay isinasagawa sa positive ion mode (ESI+).
Ayon sa pagsusuri ng fragment ng ion na isinagawa sa BDDE, ang fragment na may pinakamataas na intensity ay natukoy na ang fragment na naaayon sa 129.1 Da (Larawan 6).Samakatuwid, sa multi-ion monitoring mode (MIM) para sa quantification, ang mass conversion (mass-to-charge ratio [m/z]) ng BDDE ay 203.3/129.1 Da.Gumagamit din ito ng full scan (FS) mode at product ion scan (PIS) mode para sa LC-MS analysis.
Upang mapatunayan ang pagtitiyak ng pamamaraan, isang blangkong sample (paunang mobile phase) ang nasuri.Walang nakitang signal sa blangkong sample na may mass conversion na 203.3/129.1 Da.Tungkol sa repeatability ng eksperimento, 10 standard injection na 55 ppb (sa gitna ng calibration curve) ay nasuri, na nagreresulta sa isang natitirang standard deviation (RSD) <5% (hindi ipinakita ang data).
Ang natitirang nilalaman ng BDDE ay na-quantified sa walong magkakaibang autoclaved BDDE cross-linked HA hydrogels, na tumutugma sa apat na independiyenteng mga eksperimento.Gaya ng inilarawan sa seksyong "Mga Materyales at Paraan", sinusuri ang quantification sa pamamagitan ng average na halaga ng regression curve ng BDDE standard dilution, na tumutugma sa natatanging peak na nakita sa BDDE mass transition na 203.3/129.1 Da, na may retention. oras ng 3.43 hanggang 4.14 minuto Hindi naghihintay.Ipinapakita ng Figure 2 ang isang halimbawang chromatogram ng 10 ppb BDDE reference standard.Ang talahanayan 1 ay nagbubuod sa natitirang nilalaman ng BDDE ng walong magkakaibang hydrogel.Ang hanay ng halaga ay 1 hanggang 2.46 ppb.Samakatuwid, ang natitirang konsentrasyon ng BDDE sa sample ay katanggap-tanggap para sa paggamit ng tao (<2 ppm).
Figure 2 Ion chromatogram ng 10 ppb BDDE reference standard (Sigma-Aldrich Co), MS (m/z) transition na nakuha ng LC-MS analysis ng 203.30/129.10 Da (sa positive MRM mode).
Mga pagdadaglat: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl eter;LC-MS, liquid chromatography at mass spectrometry;MRM, maramihang pagsubaybay sa reaksyon;MS, masa;m/z, mass-to-charge ratio.
Tandaan: Ang mga sample 1-8 ay autoclaved BDDE cross-linked HA hydrogels.Ang natitirang halaga ng BDDE sa hydrogel at ang rurok ng oras ng pagpapanatili ng BDDE ay iniulat din.Sa wakas, iniulat din ang pagkakaroon ng mga bagong peak na may iba't ibang oras ng pagpapanatili.
Mga pagdadaglat: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl eter;HA, hyaluronic acid;MRM, maramihang pagsubaybay sa reaksyon;tR, oras ng pagpapanatili;LC-MS, liquid chromatography at mass spectrometry;RRT, kamag-anak na oras ng pagpapanatili.
Nakakagulat, ang pagsusuri ng LC-MS ion chromatogram ay nagpakita na batay sa lahat ng autoclaved cross-linked na HA hydrogel sample na nasuri, mayroong isang dagdag na rurok sa mas maikling oras ng pagpapanatili na 2.73 hanggang 3.29 minuto.Halimbawa, ipinapakita ng Figure 3 ang ion chromatogram ng isang cross-linked na sample ng HA, kung saan lumilitaw ang karagdagang peak sa ibang oras ng pagpapanatili na humigit-kumulang 2.71 minuto.Ang naobserbahang kamag-anak na oras ng pagpapanatili (RRT) sa pagitan ng bagong naobserbahang rurok at ang rurok mula sa BDDE ay natagpuan na 0.79 (Talahanayan 1).Dahil alam natin na ang bagong naobserbahang peak ay hindi gaanong nananatili sa C18 column na ginamit sa LC-MS analysis, ang bagong peak ay maaaring tumutugma sa isang mas polar compound kaysa sa BDDE.
Figure 3 Ion chromatogram ng cross-linked HA hydrogel sample na nakuha ng LC-MS (MRM mass conversion 203.3/129.0 Da).
Mga pagdadaglat: HA, hyaluronic acid;LC-MS, liquid chromatography at mass spectrometry;MRM, maramihang pagsubaybay sa reaksyon;RRT, kamag-anak na oras ng pagpapanatili;tR, oras ng pagpapanatili.
Upang maalis ang posibilidad na ang mga bagong peak na naobserbahan ay maaaring mga contaminant na orihinal na naroroon sa mga hilaw na materyales na ginamit, ang mga hilaw na materyales na ito ay sinuri din gamit ang parehong paraan ng pagsusuri ng LC-MS.Kasama sa mga panimulang materyales na sinuri ang tubig, 2% NaHA sa tubig, 1% NaOH sa tubig, at BDDE sa parehong konsentrasyon na ginamit sa cross-linking reaction.Ang ion chromatogram ng panimulang materyal na ginamit ay hindi nagpakita ng anumang compound o peak, at ang oras ng pagpapanatili nito ay tumutugma sa bagong peak na naobserbahan.Itinatapon ng katotohanang ito ang ideya na hindi lamang ang panimulang materyal ay maaaring maglaman ng anumang mga compound o sangkap na maaaring makagambala sa pamamaraan ng pagsusuri, ngunit walang palatandaan ng posibleng cross-contamination sa iba pang mga produkto ng laboratoryo.Ang mga halaga ng konsentrasyon na nakuha pagkatapos ng pagsusuri ng LC-MS ng BDDE at mga bagong peak ay ipinapakita sa Talahanayan 2 (mga sample 1-4) at ang ion chromatogram sa Figure 4.
Tandaan: Ang mga sample 1-4 ay tumutugma sa mga hilaw na materyales na ginamit upang makagawa ng autoclaved BDDE cross-linked HA hydrogels.Ang mga sample na ito ay hindi na-autoclave.
Mga pagdadaglat: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl eter;HA, hyaluronic acid;LC-MS, liquid chromatography at mass spectrometry;MRM, maramihang pagsubaybay sa reaksyon.
Ang Figure 4 ay tumutugma sa LC-MS chromatogram ng isang sample ng raw material na ginamit sa cross-linking reaction ng HA at BDDE.
Tandaan: Ang lahat ng ito ay sinusukat sa parehong konsentrasyon at ratio na ginamit upang isagawa ang cross-linking reaction.Ang mga numero para sa mga hilaw na materyales na sinuri ng chromatogram ay tumutugma sa: (1) tubig, (2) 2% HA aqueous solution, (3) 1% NaOH aqueous solution.Isinasagawa ang pagsusuri ng LC-MS para sa mass conversion na 203.30/129.10 Da (sa positive MRM mode).
Mga pagdadaglat: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl eter;HA, hyaluronic acid;LC-MS, liquid chromatography at mass spectrometry;MRM, maramihang pagsubaybay sa reaksyon.
Ang mga kondisyon na humantong sa pagbuo ng mga bagong peak ay pinag-aralan.Upang pag-aralan kung paano ang mga kondisyon ng reaksyon na ginamit upang makabuo ng cross-linked HA hydrogel ay nakakaapekto sa reaktibiti ng BDDE cross-linking agent, na humahantong sa pagbuo ng mga bagong peak (posibleng by-products), iba't ibang mga sukat ang isinagawa.Sa mga pagpapasiya na ito, pinag-aralan at sinuri namin ang panghuling BDDE crosslinker, na ginagamot ng iba't ibang konsentrasyon ng NaOH (0%, 1%, 0.1%, at 0.01%) sa isang may tubig na daluyan, na sinusundan ng o walang autoclaving.Ang pamamaraan ng bakterya upang gayahin ang parehong mga kondisyon ay kapareho ng pamamaraang ginamit upang makagawa ng cross-linked na HA hydrogel.Tulad ng inilarawan sa seksyong "Mga Materyales at Paraan", ang mass transition ng sample ay sinuri ng LC-MS hanggang 203.30/129.10 Da.Ang BDDE at ang konsentrasyon ng bagong peak ay kinakalkula, at ang mga resulta ay ipinapakita sa Talahanayan 3. Walang mga bagong peak ang nakita sa mga sample na hindi na-autoclave, anuman ang pagkakaroon ng NaOH sa solusyon (mga sample 1-4, Talahanayan 3).Para sa mga autoclaved sample, ang mga bagong peak ay nakikita lamang sa pagkakaroon ng NaOH sa solusyon, at ang pagbuo ng peak ay tila nakadepende sa konsentrasyon ng NaOH sa solusyon (mga sample 5-8, Table 3) (RRT = 0.79).Ang Figure 5 ay nagpapakita ng isang halimbawa ng isang ion chromatogram, na nagpapakita ng dalawang autoclaved sample sa presensya o kawalan ng NAOH.
Mga pagdadaglat: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl eter;LC-MS, liquid chromatography at mass spectrometry;MRM, maramihang pagsubaybay sa reaksyon.
Tandaan: Ang tuktok na chromatogram: Ang sample ay ginagamot ng 0.1% NaOH aqueous solution at na-autoclave (120°C sa loob ng 20 minuto).Bottom chromatogram: Ang sample ay hindi ginagamot sa NaOH, ngunit na-autoclave sa ilalim ng parehong mga kondisyon.Ang mass conversion ng 203.30/129.10 Da (sa positibong MRM mode) ay nasuri ng LC-MS.
Mga pagdadaglat: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl eter;LC-MS, liquid chromatography at mass spectrometry;MRM, maramihang pagsubaybay sa reaksyon.
Sa lahat ng mga autoclaved sample, mayroon o walang NaOH, ang konsentrasyon ng BDDE ay lubos na nabawasan (hanggang sa 16.6 beses) (mga sample 5-8, Talahanayan 2).Ang pagbaba sa konsentrasyon ng BDDE ay maaaring dahil sa katotohanan na sa mataas na temperatura, ang tubig ay maaaring kumilos bilang isang base (nucleophile) upang buksan ang epoxide ring ng BDDE upang bumuo ng isang 1,2-diol compound.Ang monoisotopic na kalidad ng tambalang ito ay iba sa BDDE at samakatuwid ay hindi maaapektuhan.Nakakita ang LC-MS ng mass shift na 203.30/129.10 Da.
Sa wakas, ipinapakita ng mga eksperimentong ito na ang pagbuo ng mga bagong peak ay nakasalalay sa pagkakaroon ng BDDE, NAOH, at ang proseso ng autoclaving, ngunit walang kinalaman sa HA.
Ang bagong peak na natagpuan sa oras ng pagpapanatili na humigit-kumulang 2.71 minuto ay nailalarawan sa pamamagitan ng LC-MS.Para sa layuning ito, ang BDDE (9.9 mg/mL) ay na-incubate sa isang 1% NaOH aqueous solution at na-autoclaved.Sa Talahanayan 4, ang mga katangian ng bagong peak ay inihambing sa kilalang BDDE reference peak (oras ng pagpapanatili na humigit-kumulang 3.47 minuto).Batay sa pagsusuri ng fragmentation ng ion ng dalawang taluktok, maaari itong tapusin na ang rurok na may oras ng pagpapanatili na 2.72 minuto ay nagpapakita ng parehong mga fragment tulad ng rurok ng BDDE, ngunit may iba't ibang intensidad (Larawan 6).Para sa rurok na tumutugma sa oras ng pagpapanatili (PIS) na 2.72 minuto, isang mas matinding rurok ang naobserbahan pagkatapos ng pagkapira-piraso sa masa na 147 Da.Sa konsentrasyon ng BDDE (9.9 mg / mL) na ginamit sa pagpapasiya na ito, ang iba't ibang mga mode ng pagsipsip (UV, λ = 200 nm) sa spectrum ng ultraviolet ay naobserbahan din pagkatapos ng paghihiwalay ng chromatographic (Larawan 7).Ang peak na may retention time na 2.71 minuto ay makikita pa rin sa 200 nm, habang ang BDDE peak ay hindi ma-obserbahan sa chromatogram sa ilalim ng parehong mga kundisyon.
Talahanayan 4 Mga resulta ng characterization ng bagong peak na may retention time na humigit-kumulang 2.71 minuto at ang BDDE peak na may retention time na 3.47 minuto
Tandaan: Para makuha ang mga resultang ito, isinagawa ang LC-MS at HPLC analysis (MRM at PIS) sa dalawang peak.Para sa pagsusuri ng HPLC, ginagamit ang UV detection na may wavelength na 200 nm.
Mga pagdadaglat: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl eter;HPLC, mataas na pagganap ng likido chromatography;LC-MS, liquid chromatography at mass spectrometry;MRM, maramihang pagsubaybay sa reaksyon;m/z, mass-to-charge ratio;PIS, pag-scan ng Ion ng produkto;ultraviolet light, ultraviolet light.
Tandaan: Ang mga mass fragment ay nakuha sa pamamagitan ng LC-MS analysis (PIS).Nangungunang chromatogram: mass spectrum ng BDDE standard sample fragment.Bottom chromatogram: Ang mass spectrum ng bagong peak na nakita (RRT na nauugnay sa BDDE peak ay 0.79).Ang BDDE ay naproseso sa 1% NaOH solution at na-autoclave.
Mga pagdadaglat: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl eter;LC-MS, liquid chromatography at mass spectrometry;MRM, maramihang pagsubaybay sa reaksyon;PIS, product ion scan;RRT, kamag-anak na oras ng pagpapanatili.
Figure 7 Ion chromatogram ng 203.30 Da precursor ion, at (A) ang bagong peak na may retention time na 2.71 minuto at (B) ang UV detection ng BDDE reference standard peak sa 3.46 minuto sa 200 nm.
Sa lahat ng mga cross-link na HA hydrogels na ginawa, napansin na ang natitirang konsentrasyon ng BDDE pagkatapos ng dami ng LC-MS ay <2 ppm, ngunit isang bagong hindi kilalang rurok ang lumitaw sa pagsusuri.Ang bagong peak na ito ay hindi tumutugma sa karaniwang produkto ng BDDE.Ang BDDE standard na produkto ay sumailalim din sa parehong kalidad ng conversion (MRM conversion 203.30/129.10 Da) na pagsusuri sa positive MRM mode.Sa pangkalahatan, ang iba pang mga analytical na pamamaraan tulad ng chromatography ay ginagamit bilang mga pagsubok sa limitasyon upang matukoy ang BDDE sa mga hydrogel, ngunit ang maximum na limitasyon sa pagtuklas (LOD) ay bahagyang mas mababa sa 2 ppm.Sa kabilang banda, sa ngayon, ang NMR at MS ay ginamit upang makilala ang antas ng cross-linking at/o pagbabago ng HA sa mga fragment ng yunit ng asukal ng mga produktong naka-cross-link na HA.Ang layunin ng mga diskarteng ito ay hindi kailanman upang mabilang ang natitirang BDDE detection sa mababang konsentrasyon tulad ng inilalarawan namin sa artikulong ito (LOD ng aming pamamaraan ng LC-MS = 10 ppb).
Oras ng post: Set-01-2021